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            一抗專題 免疫組化 天然免疫 體外診斷

            天然免疫

            內毒素污染及檢測方法(試劑)

            發布時間:2022-06-30 12:54:36 點擊:3343

            內毒素,又稱脂多糖(LPS),是革蘭氏陰性細菌的主要細胞壁成份。內毒素的來源包括培養基、血清、水、緩沖溶液和其他細胞培養試劑,如胰蛋白酶。內毒素是體內外炎癥反應的有效誘導劑。內毒素污染是細胞培養和生產注射藥物中的主要問題。溶液和試劑可能是無菌但仍含有細菌成分,因此監測細胞培養試劑中是否存在內毒素至關重要。


            內毒素污染及檢測方法(試劑)

            內毒素的特點:

            ? 3 - 40 kDa:取決于O抗原的大小

            ? 兩親性:>1000 kDa 會在水溶液中形成聚集物

            ? 抗紫外線和熱穩定性 (最高180°C)

            ? 多糖:大小因細菌種類而異。在人體誘導特異性抗原反應。

            ? 脂質A:具有LPS毒性。刺激哺乳動物免疫系統。


            內毒素的污染源:

            1.水

            使用高純度水制備培養基和溶液,清潔玻璃器皿。

            2.玻璃器皿

            為了消除內毒素,必須將玻璃器皿加熱至250°C(≥30分鐘),或加熱到180°C(3 小時)。

            3.培養液、血清和添加劑

            使用前要求制造商提供內毒素水平認證或測試。

            4.塑料容器

            要求制造商提供內毒素水平和無致熱源的證明。


            體外和體內實驗的風險

            內毒素污染及檢測方法(試劑)

            內毒素在體外和體內實驗均可引起不穩定性。脂質A能夠激活細胞表面或內體的Toll樣受體4(TLR4),誘導MAP激酶(MAPK)及IRF(干擾素調節因子)通路的激活20, 21。盡管內毒素的作用隨濃度和細胞類型的不同而改變,但它們確實可以改變細胞形態、影響增殖和轉染效率22。此外,LPS還誘導了炎性細胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的產生,并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非經典炎癥小體,最后導致細胞焦亡20, 23。在體內實驗,低內毒素濃度可刺激免疫系統,而高濃度可引起發燒、低血壓、多器官衰竭,甚至死亡22。


            使用生物試劑檢測內毒素


            細胞比色分析法


            HEK-Blue? LPS Detection Kit 2

            ??用途廣泛:適用于幾乎所有的生物試劑

            ??高靈敏度:檢測限為 0.01 EU/ml

            ? 經濟實惠:1個試劑盒最多可進行500次測試


            試劑盒依賴于InvivoGen專有的HEK-Blue?-4細胞,該細胞穩定表達人源TLR4和一個NF-κB誘導的分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)報告基因。簡單的實驗程序使該試劑盒成為常規測試的理想選擇。只要樣品中含有微量的LPS,在與HEK-Blue?-4細胞孵育過夜后,會導致NF-κB的激活和SEAP報告基因的表達。培養上清液中的SEAP活性通過加上底物QUANTI-Blue?溶液,并使用分光光度計在620-655nm的波長測量。吸光度與內毒素含量成正比。使用試劑盒中提供的HEK-Blue?內毒素標準品,經系列稀釋獲得標準曲線從而計算內毒素濃度(大腸桿菌055:B5 LPS 的制備參照FDA批準的內毒素工作標準品(CSE)制備標準)。HEK-Blue? LPS檢測試劑盒2也是InvivoGen內部的常規內毒素檢測方法。


            LPS檢測試劑盒2的原理(見下圖)

            內毒素污染及檢測方法(試劑)


            使用此試劑盒的5大原因


            1.替代昂貴而耗時的鱟試劑(LAL)。購買此套件一次,凍存HEK-Blue?-4細胞,以后只需重新訂購其他耗材。

            2.與LAL分析不同,如果樣品含有(1,3)-β-D-葡聚糖,使用HEK-Blue?-4細胞進行LPS檢測不會導致假陽性。

            3.適用于所有生物樣品,包括培養基、血清、化學制劑和疫苗佐劑。

            4.溶液顏色從粉紅色變為紫/藍色表示陽性反應,結果簡單可視。

            5.包括一本實驗程序小冊子,計算內毒素濃度的方法,以及疑難排解部分


            相關文獻:

            — Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.

            — Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous 

            Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.


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            產品說明規格貨號
            HEK-Blue? LPS Detection Kit 2Assay for the detection and quantification of biologically active LPS1 kitrep-lps2
            HEK-Blue? SelectionAntibiotics for maintenance of HEK-Blue? cells10 x 1 mlhb-sel
            HEK-Blue? Endotoxin StandardStandardized E. coli 055:B5 LPS10 x 50 EUrep-hbes-10
            QUANTI-Blue? SolutionAlkaline phophatase detection medium (liquid form, 100X) 5 ml

            10 ml

            rep-qbs

            rep-qbs2


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