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天然免疫

內毒素污染及檢測方法(試劑)

發(fā)布時(shí)間:2022-06-30 12:54:36 點(diǎn)擊:4028

內毒素,又稱(chēng)脂多糖(LPS),是革蘭氏陰性細菌的主要細胞壁成份。內毒素的來(lái)源包括培養基、血清、水、緩沖溶液和其他細胞培養試劑,如胰蛋白酶。內毒素是體內外炎癥反應的有效誘導劑。內毒素污染是細胞培養和生產(chǎn)注射藥物中的主要問(wèn)題。溶液和試劑可能是無(wú)菌但仍含有細菌成分,因此監測細胞培養試劑中是否存在內毒素至關(guān)重要。


內毒素污染及檢測方法(試劑)

內毒素的特點(diǎn):

? 3 - 40 kDa:取決于O抗原的大小

? 兩親性:>1000 kDa 會(huì )在水溶液中形成聚集物

? 抗紫外線(xiàn)和熱穩定性 (最高180°C)

? 多糖:大小因細菌種類(lèi)而異。在人體誘導特異性抗原反應。

? 脂質(zhì)A:具有LPS毒性。刺激哺乳動(dòng)物免疫系統。


內毒素的污染源:

1.水

使用高純度水制備培養基和溶液,清潔玻璃器皿。

2.玻璃器皿

為了消除內毒素,必須將玻璃器皿加熱至250°C(≥30分鐘),或加熱到180°C(3 小時(shí))。

3.培養液、血清和添加劑

使用前要求制造商提供內毒素水平認證或測試。

4.塑料容器

要求制造商提供內毒素水平和無(wú)致熱源的證明。


體外和體內實(shí)驗的風(fēng)險

內毒素污染及檢測方法(試劑)

內毒素在體外和體內實(shí)驗均可引起不穩定性。脂質(zhì)A能夠激活細胞表面或內體的Toll樣受體4(TLR4),誘導MAP激酶(MAPK)及IRF(干擾素調節因子)通路的激活20, 21。盡管內毒素的作用隨濃度和細胞類(lèi)型的不同而改變,但它們確實(shí)可以改變細胞形態(tài)、影響增殖和轉染效率22。此外,LPS還誘導了炎性細胞因子如TNF-α 、IL-1β 、IL-6 、IL-8 和 IL-18的產(chǎn)生,并激活 caspase 4/5/11-NLRP3 非經(jīng)典炎癥小體,最后導致細胞焦亡20, 23。在體內實(shí)驗,低內毒素濃度可刺激免疫系統,而高濃度可引起發(fā)燒、低血壓、多器官衰竭,甚至死亡22。


使用生物試劑檢測內毒素


細胞比色分析法


HEK-Blue? LPS Detection Kit 2

??用途廣泛:適用于幾乎所有的生物試劑

??高靈敏度:檢測限為 0.01 EU/ml

? 經(jīng)濟實(shí)惠:1個(gè)試劑盒最多可進(jìn)行500次測試


試劑盒依賴(lài)于InvivoGen專(zhuān)有的HEK-Blue?-4細胞,該細胞穩定表達人源TLR4和一個(gè)NF-κB誘導的分泌型胚胎堿性磷酸酶(SEAP)報告基因。簡(jiǎn)單的實(shí)驗程序使該試劑盒成為常規測試的理想選擇。只要樣品中含有微量的LPS,在與HEK-Blue?-4細胞孵育過(guò)夜后,會(huì )導致NF-κB的激活和SEAP報告基因的表達。培養上清液中的SEAP活性通過(guò)加上底物QUANTI-Blue?溶液,并使用分光光度計在620-655nm的波長(cháng)測量。吸光度與內毒素含量成正比。使用試劑盒中提供的HEK-Blue?內毒素標準品,經(jīng)系列稀釋獲得標準曲線(xiàn)從而計算內毒素濃度(大腸桿菌055:B5 LPS 的制備參照FDA批準的內毒素工作標準品(CSE)制備標準)。HEK-Blue? LPS檢測試劑盒2也是InvivoGen內部的常規內毒素檢測方法。


LPS檢測試劑盒2的原理(見(jiàn)下圖)

內毒素污染及檢測方法(試劑)


使用此試劑盒的5大原因


1.替代昂貴而耗時(shí)的鱟試劑(LAL)。購買(mǎi)此套件一次,凍存HEK-Blue?-4細胞,以后只需重新訂購其他耗材。

2.與LAL分析不同,如果樣品含有(1,3)-β-D-葡聚糖,使用HEK-Blue?-4細胞進(jìn)行LPS檢測不會(huì )導致假陽(yáng)性。

3.適用于所有生物樣品,包括培養基、血清、化學(xué)制劑和疫苗佐劑。

4.溶液顏色從粉紅色變?yōu)樽?藍色表示陽(yáng)性反應,結果簡(jiǎn)單可視。

5.包括一本實(shí)驗程序小冊子,計算內毒素濃度的方法,以及疑難排解部分


相關(guān)文獻:

— Gray M. A. et al., 2020. Nat Chem Biol. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. DOI: 10.1038/s41589-020-0622-x.

— Imbert P. R. C. et al., 2021. Curr Biol. An Acquired and Endogenous 

Glycocalyx Forms a Bidirectional “Don’t Eat” and “Don’t Eat Me” Barrier to Phagocytosis. DOI: 10.1016/j.cub.2020.09.082.


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產(chǎn)品名稱(chēng)
產(chǎn)品說(shuō)明規格貨號
HEK-Blue? LPS Detection Kit 2Assay for the detection and quantification of biologically active LPS1 kitrep-lps2
HEK-Blue? SelectionAntibiotics for maintenance of HEK-Blue? cells10 x 1 mlhb-sel
HEK-Blue? Endotoxin StandardStandardized E. coli 055:B5 LPS10 x 50 EUrep-hbes-10
QUANTI-Blue? SolutionAlkaline phophatase detection medium (liquid form, 100X) 5 ml

10 ml

rep-qbs

rep-qbs2


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