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天然免疫

mRNA疫苗與天然免疫——InvivoGen綜述

發(fā)布時(shí)間:2023-08-20 12:31:13 點(diǎn)擊:2981

信使核糖核酸(Messenger RNA,mRNA)技術(shù)開(kāi)辟了疫苗學(xué)的新紀元。這篇綜述簡(jiǎn)要介紹了mRNA疫苗的發(fā)展,以及mRNA與納米遞送系統產(chǎn)生的先天免疫反應。

 

The rise of mRNA vaccines

mRNA疫苗領(lǐng)域在新冠疫情中得到了快速發(fā)展,輝瑞/BioNTech Moderna分別研制的兩款mRNA新冠疫苗更首先獲得美國FDA的緊急使用授權1,使得mRNA疫苗受到大眾的廣泛關(guān)注。事實(shí)上,mRNA技術(shù)建立在多年的研究基礎之上,其概念驗證研究最早可以追溯到三十多年前,當時(shí)Wolff et al.注意到將裸mRNA注射到小鼠骨骼肌能夠在小鼠體內實(shí)現外源性蛋白的表達2。之后在1990年代的研究mRNA也被證明可以在體外和體內引發(fā)體液和細胞免疫反應3。不過(guò),礙于mRNA本身結構不穩定,在體內應用后很容易降解,以及會(huì )誘發(fā)不必要的先天免疫反應3,mRNA技術(shù)有很長(cháng)一段時(shí)間被認為其臨床應用性較低。隨著(zhù)近十多年科學(xué)的進(jìn)步,這些mRNA疫苗的研發(fā)難點(diǎn)逐漸被克服,例如通過(guò)進(jìn)行化學(xué)修飾使mRNA增加穩定性和調節免疫原性、使用納米粒子技術(shù)提高mRNA的胞內表達和遞送效率等。其中,脂質(zhì)納米顆粒(LNP)是當前最主流的mRNA疫苗的納米遞送系統。LNP-mRNA技術(shù)平臺現時(shí)已被廣泛應用在各種疾?。ㄈ绨┌Y、傳染病或遺傳疾?。┑念A防性疫苗或治療性疫苗的臨床前或臨床研究4。


Overcoming the innate immune responses

mRNA是由DNA作為模版轉錄而來(lái)、帶有蛋白質(zhì)合成編碼信息的一類(lèi)單鏈RNAssRNA)。合成mRNA可以通過(guò)體外轉錄酶促反應(in vitro transcription enzymatic reaction,IVT)產(chǎn)生3。不過(guò),由于RNA具有天然的免疫刺激特性,在進(jìn)入細胞時(shí),外源的體外轉錄mRNA會(huì )被機體免疫防御系統的第一道防線(xiàn)識別,激活不同的模式識別受體(PRRs),例如位于內體的TLR7/85。而IVT制備過(guò)程除了產(chǎn)生目的產(chǎn)物mRNA本身外,還會(huì )產(chǎn)生各種副產(chǎn)物。其中主要的副產(chǎn)物雙鏈RNAdsRNA)可以被TLR3和細胞質(zhì)中的RIG-I/MDA-5特異性識別5。PRRsRNA的感知會(huì )觸發(fā)信號轉導級聯(lián)反應,導致產(chǎn)生IFN-αIFN-βI型干擾素和促炎性細胞因子(見(jiàn)圖15。這些先天免疫激活可以有不良的影響,它們可以抑制mRNA的翻譯和蛋白抗原合成,甚至引發(fā)細胞死亡,最終降低mRNA疫苗的有效性。

 

為了克服這種先天免疫應答,Kariko? et al.首先嘗試化學(xué)修飾IVT mRNA,他們通過(guò)使用天然存在的假尿苷(Pseudouridine,Ψ)來(lái)替換RNA序列的尿苷堿基6。這種修飾模擬內源性mRNA,成功減少了mRNA與機體的TLR7/8和其他免疫傳感器的結合,限制IIFN的過(guò)度產(chǎn)生并提高mRNA的翻譯能力6。除了Ψ,常用的mRNA修飾還有N1-甲基偽尿苷(N1-methylpseudouridine,m1ψ)。研究發(fā)現與ψ修飾相比,引入m1ψmRNA序列在增強蛋白表達的能力和逃脫機體天然免疫應答的表現更好,尤其是在減少TLR3激活反應方面7。此外,為了進(jìn)一步避免不必要的先天免疫激活,從IVT mRNA中去除dsRNA雜質(zhì)是非常重要。IVT mRNA的純化方法可以通過(guò)基于微珠的沉淀和色譜方法來(lái)實(shí)現,例如高效液相色譜(HPLC4。

 

Formulating mRNA with LNPs

經(jīng)修飾的mRNA轉錄物可以依靠LNP載體來(lái)保護其免于被細胞外的RNA酶(RNAse)降解,協(xié)助其順利進(jìn)入細胞和內體逃逸3。不過(guò),載體分子也可以與疫苗的免疫原性相關(guān)。LNP通常由不同比例的磷脂、膽固醇、可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)和PEG-脂質(zhì)組成4。盡管磷脂和膽固醇作為天然的細胞膜成分不太可能觸發(fā)顯著(zhù)的先天免疫應答,但一些可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)可以通過(guò)激活PRR通路誘導炎癥反應8。例如,Lonez et al.發(fā)現diC14-amidine脂質(zhì)體可刺激TLR49;另一種陽(yáng)離子脂質(zhì)RPR206252也被發(fā)現可以通過(guò)TLR2NLRP3通路激活炎癥反應10。此外,其他成分如PEG被指出可以激活補體系統,觸發(fā)機體的超敏反應。LNP遞送系統的設計依然需要持續優(yōu)化,充分評估不同組件成分的炎癥性質(zhì),以調節與體內的先天免疫系統的相互作用。

 

mRNA疫苗與天然免疫綜述

Fig. 1: IVT mRNA and dsRNA byproducts-induced immune activation


Innate immune activation assessment

先天免疫感應機制對mRNA疫苗可能是一把雙刃劍。如上文所述,它可能抑制蛋白表達或導致過(guò)度的炎癥反應;不過(guò),預防性疫苗或某些類(lèi)型的癌癥疫苗可能會(huì )受益于其佐劑效應12。例如有研究顯示輝瑞/BioNTech的新冠mRNA疫苗BNT162b2在小鼠體內通過(guò)MDA-5信號通路來(lái)誘導機體產(chǎn)生S蛋白特異性的CD8+ T細胞13,這種免疫反應可能有助提高疫苗效力的持久性。重要的是,mRNA疫苗的成分除了需要精心設計,也需要一個(gè)靈敏而強大的平臺來(lái)評估它們的免疫原性,以確定mRNA疫苗的初步安全性和有效性。InvivoGen提供了一系列的PRR報告細胞,可以幫助測試納米材料和mRNA制劑的免疫刺激特性,例如我們的HEK293衍生的TLR3TLR7報告基因細胞被Coolen et al.用來(lái)比較兩種不同納米顆粒材料的mRNA疫苗的免疫激活14;Son et al.采用了InvivoGenHEK293衍生的TLR4TLR7報告基因細胞系來(lái)檢測不同mRNA納米載體在TLR信號通路的參與15(產(chǎn)品信息請參見(jiàn)下文)。

 

References

1.U.S. Food and Drug Administration, 2022. Regulatory information, FDA-2020-D-1137. 2.Wolff, J.A. et al. 1990. Science 1990, 247, 1465–1468. 3.Rosa, S.S. et al. 2021. Vaccine, 39(16), 2190-2200. 4.Hou, X. et al. 2021. Nat Rev Mater 6, 1078–1094 (2021). 5.Vlatkovic, I. et al. 2021. Biomedicines, 9(5), 530. 6.Karikó, K. et al. 2008. Molecular therapy, 16(11), 1833-1840. 7.Andries, O. et al. 2015. Journal of Controlled Release, 217, 337-344. 8.Igyártó, B.Z. et al. 2021. Current opinion in virology, 48, 65-72. 9.Lonez, C. et al. 2015. Cell Mol. Life Sci. 2015, 72, 3971–3982. 10.Lonez, C. et al. 2014. Nanomedicine 2014, 10, 775–782. 11.Kozma, G.T. et al. 2019. ACS Nano 2019, 13, 9315–9324. 12.Pardl, N. et al. 2018. Nature reviews Drug discovery, 17(4), 261-279. 13.Li, C. et al. 2022. Nature Immunology, 23(4), 543-555. 14.Coolen, A.L. et al. 2019. Biomaterials, 195, 23-37. 15.Son, S. et al. 2020. Nano letters, 20(3), 1499-1509.

 

InvivoGen’s solutions to accelerate your mRNA research

PRR REPORTER CELL LINES

InvivoGen一系列的人源和鼠源PRR報告細胞系穩定表達了一個(gè)功能性PRR基因,適用于評估您的mRNA轉錄物和遞送材料的免疫原性。除了TLRs報告細胞外,我們還提供一系列表達CLRs、CDSs、STING、NLRs、RLRs、AhR或炎癥小體等的細胞系以滿(mǎn)足您的實(shí)驗需求。這些細胞系以SEAP(分泌性胚胎堿性磷酸酶)和/Lucia熒光素酶報告基因的表達作為讀出,在細胞接受刺激后,您可以使用我們專(zhuān)有的報告檢測試劑來(lái)監測信號通路的活化,得出快速可靠的結果。我們每條細胞系都通過(guò)各種方法的徹底驗證,例如PCR、DNA測序、Western-Blot、FACS 和功能測定。


CELL LINEPRODUCTPATHWAY STUDIEDREPORTERCAT.CODE
HEK293 (Human)HEK-Blue? hTLR3Human TLR3 / NF-κBSEAPhkb-htlr3
HEK-Blue? hTLR4Human TLR4 / NF-κBSEAPhkb-htlr4
HEK-Blue? hTLR7Human TLR7 / NF-κBSEAPhkb-htlr7
HEK-Blue? hTLR8Human TLR8 / NF-κBSEAPhkb-htlr8


PRR SCREENING SERVICE

為了令您節省更多的實(shí)驗時(shí)間及精力,InvivoGen也提供高質(zhì)量的篩選服務(wù),利用我們改造過(guò)的HEK293細胞幫助您確定候選疫苗材料的免疫特征。篩選參數可以從一組PRRs中選擇,包括TLRs、NOD1/2、RIG-I/MDA-5、Dectin-1、Mincle和STING。 篩選服務(wù)分為兩個(gè)級別(見(jiàn)下表),可以單獨或按順序執行。此外,我們的篩選服務(wù)快速,僅需三周的周轉時(shí)間,助您加快mRNA疫苗前期研究。


SERVICEDESCRIPTIONCAT.CODE
Compound ProfilingSingle dose testing on a set of PRRstlrl-test1
Compound Dose ResponseDose response on one or several PRRstlrl-test2


mRNA疫苗與天然免疫綜述


Fig 2: TLR Response Profile. HEK-Blue? reporter cells were stimulated with 1/10 dilution of the sample solution provided and a fixed concentration of positive controls. After 24h incubation, TLR-induced NF-κB activation was assessed by measuring the SEAP levels in cell supernatants using QUANTI-Blue?.




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